آفلاتوکسین یکی از مهمترین سموم قارچی است که میتواند در محصولاتی مانند غلات، خشکبار، دانههای روغنی، خوراک دام و برخی مواد غذایی مشاهده شود. این ترکیبات به دلیل اثرات نامطلوبی که بر سلامت انسان و حیوان دارند، باید در مواد غذایی و خوراک دام بهطور دقیق کنترل شوند.
آفلاتوکسین B1 معمولاً بهعنوان یکی از مهمترین و خطرناکترین انواع آفلاتوکسین شناخته میشود. با توجه به اینکه میزان این سموم در بسیاری از نمونهها بسیار کم است، تشخیص آنها به تجهیزات دقیق، روش آزمون معتبر و مواد شیمیایی با کیفیت مناسب نیاز دارد. یکی از روشهای رایج و دقیق برای شناسایی و اندازهگیری آفلاتوکسین، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا یا HPLC است.
چرا تشخیص آفلاتوکسین اهمیت دارد؟
وجود آفلاتوکسین در مواد غذایی و خوراک دام ممکن است در اثر رشد برخی قارچها، بهویژه گونههایی از جنس Aspergillus، ایجاد شود. رشد این قارچها معمولاً با عواملی مانند رطوبت، دمای نامناسب، نگهداری طولانیمدت و شرایط نامطلوب انبارداری ارتباط دارد.
مصرف مداوم مواد غذایی آلوده میتواند سلامت انسان و دام را تحت تأثیر قرار دهد. به همین دلیل، کنترل آفلاتوکسین در زنجیره تولید، واردات، صادرات، فرآوری و عرضه محصولات غذایی اهمیت زیادی دارد.
آزمایشهای کنترل کیفیت باید بتوانند مقدار بسیار کم این ترکیبات را با دقت مناسب شناسایی کنند. در این فرآیند، تنها دستگاه HPLC تعیینکننده نتیجه نیست؛ بلکه کیفیت مواد مصرفی، نحوه آمادهسازی نمونه و صحت کالیبراسیون نیز نقش مهمی دارند.
HPLC چگونه برای آنالیز آفلاتوکسین استفاده میشود؟
در روش HPLC، ابتدا نمونه غذایی یا خوراک دام آمادهسازی و ترکیبات موردنظر از بافت نمونه استخراج میشوند. پس از انجام مراحل مختلف مانند خردکردن، استخراج، صافکردن و در صورت نیاز خالصسازی، محلول آمادهشده به دستگاه تزریق میشود.
دستگاه HPLC ترکیبات موجود در نمونه را بر اساس ویژگیهای شیمیایی آنها از یکدیگر جدا میکند. سپس آشکارساز، سیگنال مربوط به آفلاتوکسینها را ثبت کرده و مقدار آنها با استفاده از منحنی کالیبراسیون محاسبه میشود.
بسته به روش آزمایش، نوع ستون، فاز متحرک و آشکارساز میتواند متفاوت باشد. در برخی روشها از آشکارساز فلورسانس و در برخی کاربردهای تخصصیتر از LC-MS/MS استفاده میشود. انتخاب روش باید بر اساس نوع نمونه، حد تشخیص موردنیاز و استاندارد آزمایشگاهی انجام گیرد.
مواد شیمیایی موردنیاز برای آنالیز آفلاتوکسین
یکی از عوامل مهم در افزایش اطمینان نتایج آزمایش، استفاده از مواد شیمیایی متناسب با روش آنالیز است. برخی از مواد پرکاربرد در این فرآیند عبارتاند از:
۱. حلالهای گرید HPLC
حلالهایی مانند متانول و استونیتریل در بسیاری از روشهای کروماتوگرافی بهعنوان فاز متحرک یا حلال استخراج استفاده میشوند. حلال مورد استفاده باید از گرید مناسب برخوردار باشد؛ زیرا ناخالصیهای موجود در حلال میتوانند باعث ایجاد پیکهای مزاحم، افزایش نویز زمینه یا کاهش دقت اندازهگیری شوند.
به همین دلیل، استفاده از متانول HPLC Grade یا استونیتریل HPLC Grade برای روشهایی که به حساسیت بالا نیاز دارند، اهمیت دارد. البته نوع دقیق حلال و نسبت ترکیب آن باید بر اساس روش استاندارد آزمایشگاه انتخاب شود.
۲. آب با خلوص مناسب
آب مورد استفاده در تهیه فاز متحرک و محلولهای استاندارد باید خلوص کافی داشته باشد. آب دارای یونها یا ترکیبات آلی میتواند روی پایداری سیستم، فشار دستگاه و کیفیت کروماتوگرام اثر بگذارد.
در آزمایشگاههای تخصصی معمولاً از آب خالصسازیشده متناسب با الزامات روش استفاده میشود.
۳. استانداردهای مرجع آفلاتوکسین
برای اندازهگیری کمی، به محلولهای استاندارد با غلظت مشخص نیاز است. استانداردهای آفلاتوکسین باید از منبع معتبر تهیه شوند و اطلاعاتی مانند غلظت، حلال، تاریخ انقضا، شرایط نگهداری و شماره بچ آنها مشخص باشد.
از این استانداردها برای تهیه منحنی کالیبراسیون و مقایسه پاسخ دستگاه با نمونه استفاده میشود. نگهداری استانداردها نیز باید طبق دستورالعمل تولیدکننده انجام شود؛ زیرا نور، دما و شرایط محیطی ممکن است بر پایداری آنها اثر بگذارد.
۴. فیلترها و مواد مصرفی آزمایشگاهی
فیلتر سرسرنگی، ویال، سرنگ و سایر مواد مصرفی نیز میتوانند بر نتیجه آزمایش اثرگذار باشند. انتخاب فیلتر نامناسب ممکن است موجب جذب بخشی از آنالیت یا ورود ذرات به سیستم HPLC شود.
بهتر است تمام مواد مصرفی پیش از استفاده با روش آزمون و نوع حلال سازگار باشند.
چرا گرید ماده شیمیایی اهمیت دارد؟
هر ماده شیمیایی برای کاربرد مشخصی تولید میشود. برای مثال، مادهای با گرید صنعتی ممکن است برای یک فرآیند تولیدی مناسب باشد، اما لزوماً برای آنالیز کروماتوگرافی با حساسیت بالا مناسب نیست.
در آزمون آفلاتوکسین، وجود ناخالصی در حلال یا محلولهای مورد استفاده میتواند باعث بروز مشکلات زیر شود:
- ایجاد پیکهای اضافی در کروماتوگرام؛
- افزایش نویز خط پایه؛
- کاهش حساسیت آشکارساز؛
- تغییر زمان بازداری ترکیبات؛
- کاهش تکرارپذیری نتایج؛
- آسیب به ستون یا بخشهای مختلف دستگاه.
بنابراین هنگام خرید مواد شیمیایی باید علاوه بر نام ماده، به گرید، خلوص، برند، شماره کاتالوگ، شماره CAS و کاربرد موردنظر نیز توجه شود.
خرید مواد شیمیایی مناسب برای آزمایشگاههای کنترل کیفیت
آزمایشگاههایی که در زمینه کنترل کیفیت مواد غذایی، خوراک دام یا محصولات کشاورزی فعالیت میکنند، معمولاً به مجموعهای از حلالها، استانداردهای مرجع و مواد شیمیایی تخصصی نیاز دارند. در چنین شرایطی، خرید از تأمینکنندهای که اطلاعات فنی محصول و مدارک کیفی را ارائه میکند، اهمیت زیادی دارد.
برای خرید موادی مانند حلالهای مناسب HPLC، استانداردهای آزمایشگاهی و سایر مواد مورد استفاده در آنالیزهای دستگاهی، تطبیق مشخصات محصول با روش آزمون آزمایشگاه ضروری است. کارشناسان تأمین مواد شیمیایی میتوانند در بررسی کد محصول و انتخاب گزینه متناسب با کاربرد موردنظر راهنمایی ارائه دهند.
نکاتی برای افزایش دقت آزمایش آفلاتوکسین
برای دستیابی به نتایج قابل اعتماد، رعایت چند نکته ضروری است:
- نمونهبرداری باید بهصورت اصولی و نماینده کل محموله انجام شود.
- نمونه باید در شرایط مناسب خرد و همگن شود.
- روش استخراج باید مطابق یک استاندارد معتبر یا روش اعتبارسنجیشده باشد.
- حلالها باید گرید مناسب برای HPLC یا روش مورد استفاده را داشته باشند.
- منحنی کالیبراسیون باید در محدوده موردنظر تهیه و بررسی شود.
- از بلانک، نمونه شاهد و نمونه اسپایکشده استفاده شود.
- استانداردهای مرجع در شرایط توصیهشده نگهداری شوند.
- عملکرد دستگاه و ستون بهصورت دورهای کنترل شود.
- نتایج با الزامات استاندارد یا حدود مجاز مربوط به نوع محصول مقایسه شوند.
